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中药指纹图谱技术(fingerprint technology of Chinese medicine)源于指纹鉴定学。通常是指狭义的表达植物药物代谢产物化学特征的指纹图谱,即中药化学(成份)指纹图谱,含中药材(原料药材)指纹图谱;中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。是中药生产质量的一种新型标准,可以确保中药品的一致性,疗效的安全性及可靠性,是组分群体的特征图谱,能全面反映中药品所含化学成份的种类与数量,进而反映中药材及产品的质量。采用现代分析技术,获得中药不同个体的化学成份信息,用图形或图案方式表达,进行比对和分析,可实现对中药未知物质群整体的质量控制,是实现多种成份整体相关质量评价的关键技术,也是中药创新、研究开发、质量鉴别、鉴定的必要技术手段。 中药指纹图谱-研究意义作为有着悠久文明史的中药,其安全性、有效性早已经过历史的验证。但中药的均一稳定性——即质量可控的问题则是制约中药发展,走向国际市场的瓶颈问题。传统的中药质量控制方法与现代化学合成药品的质量控制技术有着根本区别。中药一般为复方制剂,中药理论讲究君、臣、佐、使;讲究药物组方配伍;讲究因人而异、天人合一、辨症施治,方剂中有效成份极为复杂,大部分结构、作用机时尚不清楚。在现有条件下,以单一化学成份分析的观点,不适合中药(天然药物)这一复杂成份分析体系。中药材生产过程复杂,受多种因素的制约,这些都为其质量可控提出了新的课题。而解决这一难题的有效手段,就是要参照植物药的质量控制方法,借鉴化学药品质量控制模式,借助于建立相应简单理化鉴别,借助于现代的、被国际社会所认可的中药指纹图谱技术。 中药指纹图谱-特点中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
中药指纹图谱(fingerprinting)是借用DNA指纹图谱发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱,特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。HPLC具有很高的分离度,可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图,这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。由此可见,中药指纹图谱比DNA指纹图谱更进一步的发展在于:不但有特征的体现(各种化学成分的个数和相对位置——保留时间)可作定性鉴别使用,还体现了量的概念。峰的高度和峰面积表示了某个化学成分的含量,而各峰的峰高(或峰面积)的比值体现了各种化学成分间的相对含量;量的概念的引入、定性和定量的结合赋予中药指纹图谱更大的功效;中药指纹图谱不仅可以进行个体、某物种的“唯一性”的鉴定,还可以将其“量”的特征和其他体系挂钩。 因此,中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术,更可以发展成为一种采用各种指纹图语来进行中药理论(复杂系统)和新药开发的研究体系和研究模式。 中药指纹图谱-分类狭义的中药指纹图谱是指中药化学(成分)指纹图谱,广义的中药指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。
1.按应用对象分类 中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段,按应用对象来分类,可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细,还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。值得注意的是建立中药材化学指纹图谱必须考虑诸多因素的影响。中药品种混杂,历史上形成的同名异物、异名同物,以及同一物种受产地环境、不同有效部位所含成分的波动大等因素,给质量控制带来了很多困扰。因此对于某一种中药材的指纹图谱,需要有大量的数据积累,才能制定合理的相似性标准。 2.按侧定手段分类 中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱,由于每个物种基因的唯一性和遗传性,中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。 中药化学(成分)指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分(次生代谢产物)而建立的指纹图谱。虽然化学成分是次生代谢产物,受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异,但植物的代谢具有遗传性,作为同一物种的个体在化学成分上也具有相似性(similarity),可以用化学成分的谱图来建立指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱主要有光谱法和色谱法:如紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(NMR),薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE),以及各种联用技术。中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。 中药指纹图谱-分析方法与技术随着分离分析技术的发展,中药质量研究也由过去“四大鉴别”(基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别)发展到反映中药材全貌的指纹体系,即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 (除矿物、树脂类外) 特性的基因指纹图谱,从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制,为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。 1. 化学指纹图谱 中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础,最早可以追溯到20世纪60年代,如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征,这是早期的原始的指纹图谱,具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用,基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展,高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用,为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。 (1)光谱指纹图谱
紫外光谱指纹图谱 紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异,因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异,以此达到鉴别效果。常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收,排除原图谱中的某些干扰。 红外光谱(IR )指纹图谱 红外光谱又称分子振动转动光谱,是一种分子吸收光谱。当样品受到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收了某些频率的辐射,并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化,产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁,使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线,就得到红外光谱。一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别,比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同,它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定,并且样品处理方法按同一要求进行,则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。利用上述原理,不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属,只要在4000-400cm,范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面:一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异;二是在某一波数内,鉴别双方的光谱中,吸收峰的形状和强度都有明显差异;三是“指纹区”,面貌不同。 近红外光谱法 近红外光谱法(NIRS)是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术,是中红外光谱中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收,具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm,而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定,需要通过一系列样本的检测(必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属),运用化学计算学手段,建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本(例如新近购进的原药材或新生产的成品等)进行辨别分析(给出结果:合格与否、含量多少等)。该方法为非破坏性方法,可实现产品的无损检测,具有检测速度快,操作简单,所需样品少,适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理,需要掌握一定的化学计量知识。 荧光光谱 中药注射剂常含荧光性物质,但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同,同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动,均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异;根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。 荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征,但具有高灵敏度的显著优势,且差异更为一目了然,易于判断,因此,可以作为红外光谱指纹技术的一种补充,用于中药注射液的鉴别和认定,以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。 (2)色谱指纹图谱 色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段,是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。 薄层色谱(TLC)指纹图谱 TLC为传统的定性、半定量分析方法,在中国“七五”、"十一五”及“九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多,提供信息量大,用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描,所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确,因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差,所以在指纹图谱应用中受到限制,但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。 气相色谱(GC)指纹图谱
GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析,尤其是毛细管气相色谱法,分辨率很高,往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好,分析速度快,但是分析范围只是局限于低沸点成分,是指纹图谱研究的主要方法之一。 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱 HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象,具有分离效能高,灵敏度高,分析速度快,不需要气化,检测手段多等优点,是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。 高速逆流色谱(HSCCC)指纹图谱 HSCCC是当前国际流行的新型的液-液分配技术。应用动态液一液分配原理,利用相对移动互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用固相载体作固定相,克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便,容易掌握。对样品的预处理要求低,仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高,能实现梯度操作,亦能重复进样,在中药质量分析控制研究中,尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。 毛细管电泳(CE)指纹图谱 毛细管电泳(CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的电泳分离分析方法,是近年发展起来的一种新的分离技术,是电泳技术和层析技术结合的产物,兼有高压电泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特点,其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。 联用技术由于中药复方制剂成分复杂,现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱,因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维,即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱,各谱图间相互补充信息,可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前最常用的是高效液相(或气相色谱)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题,又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了种新的解决途径。除了手性化合物外,从概率上要找出4个或以上图谱信息完全相同的化合物几乎是不可能的。 (3)X射线衍射法 当某一物质进行衍射分析时,该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。可分为单晶X衍射法与粉末X衍射法。物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果该物质是一混合物,X-射线衍射图是各混合物各组分衍射效应的叠加。只要这一混合物的物质组成是恒定的,其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。X -衍射指纹图谱具有指纹性强,图谱稳定可靠等特点。尤其是X衍射Fourier谱分析法可用于动物类药材的鉴定与伪品识别。 (4)核磁共振(NMR)指纹图谱
核磁共振氢谱(1H-NMR)是鉴定有机化合物结构的重要的方法之一。它可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。如可以用一定程序获取植物类中药的特征性化学成分(或化学成分组)的总提取物,同时这些特征的化学成分的含量是相对固定的,则在规范的提取分离条件下,植物类中药的1H-NMR图谱与植物品种存在着严格的对应关系,没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后,通过结构鉴定和NMR研究,可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。 2. 分子生物指纹图谱 随着分子生物学技术的迅速发展,DNA分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的DNA指纹图谱。如对于人参、西洋参一类中药材的鉴别,用传统的方法(性状、显微、理化等鉴别方法)都显片面性,结果往往很模糊,因而其产地、生长年限、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性,但应用分子生物学技术可以迎韧而解。 中药指纹图谱-数据挖掘指纹图谱的特征信息的分析与提取又称作数据挖掘。中药指纹图谱形象地反映了药用植物物种具有遗传特性的次生代谢“共有特征”,又由于次生代谢中地域、生长环境、采收等多种不定因素影响,具有统计学中多元随机分布的“模糊性”。数据挖掘技术就是利用模糊数学、统计学、计算机技术等建立一种同时反映这两种特征的方法,即从中药指纹图谱数据信息库中提取隐含的及有潜在应用价值、最终可理解的模式的过程。它是发现和解析中药指纹图谱潜在信息的有力工具,目的是评价和控制中药质量及研究中药定量组效关系(quantitative composition-activity relationship,QCAR);包含三个过程;
1. 指纹图谱的信息化 指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化。主要过程为针对某类样品和要求,确定合适的获得指纹图谱的分析方法(如色谱或光谱等),建立整个分析方法的各种操作条件,进行测试,以获得不同样品的指纹图谱,即数据的获取。对所得指纹图谱进行分析,确定其数字特征。如对红外指纹图谱、可用峰的波数和强度作为其数字特征来表示某个峰。 2. 指纹图谱知识化 获得信息化后的指纹图谱,需要研究如何来利用这些信息,即实现指纹图谱知识化。指纹图谱知识化包括信息解读、比较和判断,化学信息和药效信息相关性研究和信息的利用,即从大量指纹图谱数据中得到有关规律和知识。采用的方法有聚类分析、模式判别、关联度分析、人工神经网络等。 (1)聚类分析 聚类分析就是根据一定的规律和要求,对研究的对象进行分类。其基本思路是用“相似度”来衡量样品之间的亲疏程度,并以此来实现分类。通常将相似度大的样本归为一类,相似度小的样本归为不同类。对于不同批次的中药样品其色谱指纹图经计算机快速辨识处理可依据样品批与批之间的相似度,确定中药样品批间的稳定性。 模糊聚类分析的基本步骤如下:
A. 计算样品之间的相似度,并将其构成模糊相似关系矩阵R。在由m个己量化的指纹特征组成的m维空间中,可用多种方法定义样品之间的相似度。如:相关系数法、最大最小法、算术平均最小法、几何平均最小法、绝对指数法、广义夹角余弦法、马氏距离法、欧氏距离法等。 B. 用上述方法建立起来的模糊相似关系矩阵R,只有自反性和对称性,而没有传递性,需要将模糊相似关系矩阵R改造为模糊等价关系矩阵R`,再进行分类。 C. 取一定M值,作等价矩阵的截矩阵,依据取值的不同得到动态聚类谱系图。 (2)模式判别 模式判别的基本思路是先建立标准样本模式的色谱指纹图谱,然后对未知模式(待鉴定样品)色谱指纹图谱进行计算机解析,依据其与标准样本模式的“隶属度”、判别未知模式的真伪及优劣。 (3)关联度分析 众所周知,衡量药品质量的终极标准是药效。采用化学分析方法控制药品质量是一种间接的质量控制手段。一般来说,西药是成分单一的化合物或化学成分明确的混合物,这些化学成分的性质和数量决定了药品的疗效,因此定性和定量地控制这些化学成分就可全面地控制药品的内在质量。但中药与西药不同,中药相当于一个大复方,其成分多而复杂,大部分中药的化学成分不完全明确,某些已知成分并不能代表中药的全部疗效,因此传统的质量控制模式即单一成分的定性与定量难以控制药品质量。就中药指纹图谱而言,也存在着指纹图谱与药效相脱节的问题。所谓关联度,是指两个系统或两个因素间关联性大小的量度。关联度描述了系统发展过程中因素间相对变化的情况。如果两者在发展过程中相对变化基本一致,则认为两者关联度大;反之,两者关联度小。 (4)人工神经网络
随着模式识别理论的发展,人工神经网络的实践也得到了迅速的提高,在诸多领域都有广泛应用。1990年以来,人工神经网络在中药研究领域逐渐得到了应用。与经典模式识别相比,神经网络法更接近人脑思维过程,具有自组织性和容错性的优点。神经网络的结构和学习算法已有很多种,在中药指纹图谱中用到的主要有BP(反向误差传播),自适应神经网络(ART),自适应线性机(MBL)及模糊神经网络(FANN)。 (5)其他 实现指纹图谱知识化的方法还包括峰重叠法、夹角法、决策树,遗传算法及近邻算法等。近来又出现了几种相似度计算的方法。 3. 中药方剂指纹图谱智能数据库 将从药材、中间体直至最终产品的大量指纹图谱汇集成数据库,采用数学方法比对等,就能确定各个峰之间的相关性,从而做到对整个生产过程实现“全过程质量管理”,而对基础研究和新药开发,则可实现全过程化学成分群的表征。再加上多维信息(HPLC/PDAD/MS/MS)的指纹图谱,对整个研究而言存在大量信息需要处理,建立指纹图谱智能数据库,就能较好的解决此类问题。 中药指纹图谱-应用当前,中药指纹图谱技术在世界已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定:如果草药的活性成份不明,可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将色谱指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。中国专业技术人员对中药指纹图谱进行了较早的研究。例如广州市药品检验所、北京大学、沈阳药科大学、陕西师范大学、陕西中医药研究院等科研单位均已从不同角度、不同层面对中药指纹图谱技术作了深入研究,有些技术已在实践中得到了应用。
中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术。因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息,只需要了解个别指标性活性组分信息,以指标性成份峰作为标记,结合非指标成份进行比对,用来综合评价药物质量,既符合中医药理论的整体观点,也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。 运用中药指纹图谱和指标成份定量相结合的方式,既可以完善表述中药的整体性特征,又别于西药单一成份定量的质量控制模式,要根据中国的国情,建立自己的中药质量控制体系,评价体系,尽快建立一支高水准、高素质的科研院所和专业技术队伍,使中药指纹图谱技术得以推广和应用。 中药指纹图谱是用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系,质量稳定性进行评价的检测方法。又是分析科学、中药学、分离科学以及化学、生物信息学等二级学科交叉,综合应用研究的结果,是中药现代质量标准体系的核心技术之一,又是解决药品质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法。通过相似性和相关性比对,发展质量变异和缺陷,从而全面特异地把握住中药的质量命脉。又为中药新药研发带来了一种崭新的研究模式,从整体综合的角度把握住了药物多靶点作用及针对性,为新药发现和快速筛选提供了思路和方法。 中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体的讲,就是从中药物质基础的角度出发,运用现代分离分析科学的手段,获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成份的分离鉴定,经效谱关系研究,获取中药药效组分指纹图谱,并将已取得的指纹图谱用于中药材,中间体和中药复方制剂的质量控制,以及创新药物研究的实践中,最终解决中药质量评价的科学性和关键问题;解决制约中药发展,走向国际市场的瓶颈问题。 中药指纹图谱质控技术又与GAP基地建设,SOP质量管理息息相关。中药生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键,而中药指纹图谱技术又是中药现代化建设的主要技术手段之一,对中药“安全、有效和质量可控”,保证物种的延续,遗传基因的稳定性,品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用。 中药指纹图谱-前景
中药指纹图谱质控技术是中药质量标准现代化的突破口,将现代分析学的优秀成果与中医药整体综合观有机融合,有效地运用了全面质量管理的理念,能对中药复杂体系特性作出科学的表达。可用于成品质量、工艺操作、原料材料的质量控制和监测,使其符合GAP的质量要求。这对企业的发展提高竞争力是极为有利的,也是我们推行中药指纹图谱技术,提高中药质量评价技术水平和科技含量,使其为国际社会所公认,实现与国际双向接轨,挤身国际市场,把中药产业做大做强的根本目的之所在。指纹图谱的建立虽然处于初步的探索阶段,还存在着许多困难,如中药化学成分的不确定性,与药理作用的相关性和与实验条件的一致性等等。但是随着中医药现代化的发展,必然将发挥更大的作用。 中药指纹图谱-参考文献[1] http://www.ivdc.gov.cn/knowlege/zy/zyjd/zyzwtp/t20041108_15797.htm |
本文来源:http://www.xieat.com/shijie/95568/
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